Các kỹ thuật đối chiếu protein

quý khách sẽ hy vọng dấn diện cùng định danh protein? Chúng tôi gồm 10 năm kinh nghiệm tay nghề để lấy ra câu vấn đáp đúng đắn độc nhất và nkhô giòn độc nhất vô nhị theo yêu cầu của bạn!


Đây là phép tắc truyền thống lâu đời cơ mà được ứng dụng rộng thoải mái và có rất nhiều vai trò đặc biệt vào nghiên cứu và phân tích protein. Thứ nhất bọn chúng làm cho những mẫu mã phức tạp trsống nên dễ dàng hơn bằng cách phân tách bóc hỗn hợp mẫu mã thành những protein độc thân hoặc những nhóm nhỏ dại. Thđọng nhị, bọn chúng cho phép riêng biệt sự khác nhau về cường độ biểu thị của protein, cùng so sánh giữa những chủng loại. Có 5 chuyên môn thiết yếu để phân tách protein đó là năng lượng điện di 1 chiều SDS-PAGE, năng lượng điện di 2-DE, năng lượng điện di đẳng năng lượng điện IEF, nhan sắc ký kết lỏng nano hiệu năng cao HPLC, ngoại giả còn những phương pháp phân bóc tách khác biệt tùy nằm trong vào mục tiêu với nhu yếu thực hiện.

Bạn đang xem: Phân tích protein bằng điện di

Điện di SDS-PAGESDS-PAGE được thực hiện theo LaemLi <71>. Trong phương pháp này, các phân tử protein được phân tách theo trọng lượng bên dưới tính năng của năng lượng điện ngôi trường ko đổi. Protein được phân tách bóc vào gel polyacrylamide cùng với các nồng độ không giống nhau. Dưới tác dụng của loại điện một chiều, những protein tất cả kích thước khác biệt đã dịch chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein thêm cùng với SDS đề nghị bọn chúng đã tích điện âm, cho nên vì vậy sự khác hoàn toàn về năng lượng điện được sa thải.
 
*
  
khi protein được chạy vào điện ngôi trường không đổi, phức hệ protein-SDS đã dịch rời chiếu thẳng qua các lỗ gel polyacrylamid cùng với tốc độ phục ở trong vào dáng vẻ, size phân tử. lúc kia protein sẽ được phân tách thành các băng, gạch không giống nhau. Gel thường được sử dụng với nồng độ trường đoản cú 5%-15% với rất có thể được đuổi theo chiều nằm ngang hoặc chiều thẳng đứng (Hình 5) <40>.Điện di 2-DE­Ngày này, kỹ thuật năng lượng điện di 2 chiều (two-dimensional electrophoresis, 2DE) càng ngày càng biến hóa một giải pháp được ứng dụng rộng rãi nhằm mục tiêu phân tách các tinh vi protein trong tế bào, mô với những dịch khung người <46>. Phương thơm pháp năng lượng điện di hai chiều, thủy phân protein vào gel, kế tiếp nhấn dạng bởi kăn năn phổ đã là một trong những phương pháp truyền thống lâu đời hay sử dụng tốt nhất. Tùy trực thuộc vào kích thước lỗ gel cùng giải gradient pH sử dụng, năng lượng điện di 2-DE rất có thể phân tách hàng chục ngàn protein (5000 protein, với hoàn toàn có thể phạt hiện tại vệt protein cùng với lượng      
*

 Kỹ thuật điện di 2-DE thực ra là việc phối hợp của nhì nguyên tắc phân bóc tách khác nhau. Theo chiều đầu tiên, những phân tử protein được phân bóc tách dựa trên điểm đẳng năng lượng điện pI vì chưng nguyên tắc quy tụ theo điểm đẳng năng lượng điện IEF (Isoelectric focusing) trên một tkhô cứng strip gồm giải gradient pH xác định (ví dụ dải pH 3-10). Chiều sản phẩm nhị, các phân tử protein được phân tách bóc bên trên điện di bên trên gel polyacrylamid (nhỏng điện di SDS-PAGE) (hình 6). Do kia, thực tế 2-DE là phương thức phân tách bóc protein theo 2 chiều, (i) chiều đầu tiên theo năng lượng điện và (ii) chiều thiết bị nhị theo trọng lượng phân tử.Sự khác biệt về điểm đẳng điện pI (Isoelectric ponit) của các protein đó là đại lý của IEF. pI là cực hiếm pH trên kia điện tích bề mặt tổng cộng của protein bằng 0 (protein không dịch chuyển vào điện trường). Mỗi protein tất cả một quý giá pI khẳng định. Tkhô cứng gel IPG (immobilized pH gradient) tạo nên một giải gradient pH cố định và thắt chặt, thường xuyên và tăng nhiều với chiều nhiều năm khác nhau (7 centimet, 11 centimet, 18 centimet, 24 cm) đã tiêu giảm sự di chuyển, xiêu dạt của các chất hóa học (vày chúng được đính trên gel polyacrylamid) khiến cho quá trình phân tách định hình hơn <84>. Ngoài điện di 2DE những kỹ thuật khác như năng lượng điện di mao quản, điện di trường xung cũng thường xuyên được thực hiện để phân bóc tách proteinSắc ký kết lỏng nano nhiều chiều (2DnanoLC)Mặc mặc dù 2-DE được áp dụng rộng thoải mái nhỏng một phương thức truyền thống nhằm phân tách bóc protein nhưng tiêu giảm của chính nó là độ tinh tế rẻ, không tự động hóa, mất thời hạn, tốn kém, tiến hành nhiều lần tạo ra không nên số. Do kia phương pháp này gặp gỡ những trở ngại trong quy trình phân tích những protein tất cả hàm lượng rẻ hoặc các protein có tính kỵ nước cao (như protein màng). Để thừa qua những tiêu giảm này dung nhan ký lỏng nano đa chiều (multidimensional nano liquid chromatography - MDnanoLC) được pháp triển như là một trong những phương thức sửa chữa thay thế kết quả (hình 8) <87>.
 
  
*

Bằng sự phối kết hợp của những kỹ thuật phân bóc các cột liên tiếp nhau phụ thuộc vào sự kết hợp của phương thức sắc đẹp ký dàn xếp ion (SCX), nhan sắc cam kết ái lực với phương thức sắc đẹp ký ngược trộn (RP) <121>. Điểm đáng để ý trong phương pháp này, chính là form size cột khôn cùng nhỏ bé (ID vài mm), với tốc độ chiếc khôn cùng tốt (0,2 ml/phút).
Pmùi hương pháp nhan sắc cam kết lỏng nano nhiều chiều kết nối trực con đường cùng với hệ kân hận khối QSTAR XL sử dụng các kế hoạch cột sắc ký kết những chiều khác biệt cùng với 2 lần bán kính cột với vận tốc chiếc cực thấp sẽ cùng đang được thực hiện mạnh bạo nhằm phân tách bóc cùng dấn diện các chủng loại tinh vi <7>. Điểm đặc biệt của cách thức này chính là có thể thực hiện lượng chủng loại nhỏ dại, tự động hóa, đúng đắn với có khả năng phân bóc tốt những peptid đồng thời chỉ trong một lần chạy <120>. Ngoài sắc cam kết lỏng nano, những cách thức khác như sắc đẹp ký kết hiệu năng cao HPLC, sắc cam kết ái lực, nhan sắc cam kết ngược pha cũng rất được thực hiện phối kết hợp để phân bóc tách protein. Sự kết hợp này được Call là sắc đẹp cam kết liên tục (tandem LC).
 Kân hận phổ - Trung trọng tâm của proteomics Pmùi hương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) càng ngày được chọn lọc nhằm phân tích các tinh vi protein, là 1 trong những chuyên môn được vận dụng rộng rãi tuyệt nhất cùng cần thiết sửa chữa thay thế trong các nghiên cứu và phân tích các thành phần hỗn hợp protein trong thời gian cách đây không lâu <7, 9, 18, 30>. Proteomics dựa trên nguyên lý khối hận phổ đã trở thành một môn công nghệ đích thực nhờ có các dữ liệu về trình từ bỏ ren và genome với những thành công vượt trội trong vô số lĩnh vực <2>. Việc cách tân và phát triển các đồ vật kân hận phổ bao gồm độ sắc nét, độ nhạy bén, độ chính xác với tự động hóa ngày càng tốt tạo nên kân hận phổ trở thành trung trọng tâm trong nghiên cứu protein và nghành nghề dịch vụ proteomics trngơi nghỉ bắt buộc kỳ trúc hơn. Các kỹ thuật này càng ngày càng không thể sửa chữa nhằm phân tích và lý giải đầy đủ công bố được mã hoá trong genome.
Khối phổ là nghệ thuật so với đo phổ về khối lượng của các phân tử tích điện Lúc chúng di chuyển trong điện ngôi trường. Mẫu được ion hóa trở nên những phân tử tích năng lượng điện không giống nhau với được phân bóc phụ thuộc sự không đúng không giống về quý giá m/z. Dữ liệu phổ kăn năn được tự động lưu lại với thực hiện để nhấn dạng protein bởi những pháp luật tin sinc học tập.Hoạt rượu cồn với cấu trúc thông thường của máy khối phổBan đầu, chủng loại (i) được ion biến thành các ion sinh hoạt các trạng thái tích điện khác nhau, (ii) tiếp đến những ion mẫu sẽ tiến hành phân bóc dựa vào sự biệt lập về quý giá m/z, (iii) ghi dữ liệu phổ về khối hận của những ion sẽ phân tách với việc trợ giúp của những phần mềm tin sinh học tập cho phép tra cứu tìm trên những các đại lý tài liệu cùng đối chiếu tác dụng nhận được. Máy kăn năn phổ không đo cân nặng (m) cơ mà bọn chúng đo giá trị m/z (mass/charge ratio).

Xem thêm: Ghế Tolix Là Gì - Ghế Tolix: Tập Hợp Các Sản Phẩm Bàn Ghế Tolix


Hệ thống khối phổ có rất nhiều các loại với được vận dụng cực kỳ nhiều chủng loại trong những nghành nghề dịch vụ khác nhau. Trong đó, tất cả nhị loại khối hệ thống thường được sử dụng chủ yếu trong proteomics là MALDI-TOF cùng ESI-MS/MS <2, 10>. Hai hệ thống này hơi không giống nhau nhưng mà bổ sung cập nhật lẫn nhau với 1 mục đích là dìm dạng protein. Máy khối hận phổ tất cả 3 phộ phận thiết yếu đó là (i) mối cung cấp ion hóa mẫu, (ii) bộ phận phân tích khối, (iii) phần tử ghi phổ (detector). Tùy nằm trong vào những loại mối cung cấp với cỗ so với khối nhưng trang bị kân hận phổ tất cả thông số kỹ thuật với lý lẽ chuyển động không giống nhau. Hình 9 minh họa sơ thiết bị cấu trúc đơn giản dễ dàng của hệ thống khối hận phổ.
*
Có 2 nhiều loại nguồn ion hóa mẫu mã hay được sử dụng chính là mối cung cấp MALDI với ESI.Kỹ thuật MALDI-TOF
MALDI là thuật ngữ chỉ cách thức ion hóa mẫu mã hấp thụ dựa trên sự cung ứng của các hóa học nền cùng năng lượng laser (Matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI). Nguồn MALDI sử dụng các chất nền cung cấp để ion hóa mẫu bên dưới tác dụng của tích điện laser phệ.
  
*

Ban đầu, mẫu được xử lý, làm cho tinh sạch bằng những cách thức khác biệt. Sau đó mẫu mã so sánh được trộn cùng với các chất nền (các axit yếu hèn nlỗi sinapinic) cất những phân tử hữu cơ nhỏ tuổi có khả năng hấp thụ tích điện ánh sáng sinh hoạt phần lớn bước sóng cố định. Hỗn đúng theo mẫu cùng chất nền được đưa lên khay cùng bay hơi sinh sản thành những phân tử tinch thể bám cùng với peptid. Dưới tác dụng của mối cung cấp năng lượng laser cực to chiếu vào có tác dụng cho những hóa học nền (axit yếu) hấp thụ tích điện cùng nhảy ra những photon. Mẫu được kêt nạp photon và năng lượng sẽ tiến hành đi vào hệ thống kân hận phổ TOF. Các ion dương thường được tạo ra so với chủng loại dạng những peptid/protein. Mỗi peptid gồm xu hướng dung nạp một photon hiệu quả là ion peptid đã tích điện dương +1.Phương thơm pháp MALDI-TOF và MALDI-TOF MS hay được sử dụng cho các chủng loại protein đơn giản và dễ dàng, cùng hơi tinch sạch <10>. Ưu điểm là có thể giải trình từ bỏ axit amin mảnh peptid với đo chính xác trọng lượng, nhưng lại nó lại ko tương thích mang đến Việc so với hỗn hợp protein phức hợp.Kỹ thuật ESI-MS/MSESI (ElectroSpray Ionization) là thuật ngữ chỉ phương thức ion hóa chủng loại bởi phương pháp xịt chùm ion vào hỗn hợp tạo thành thành đám sương mù cùng với những giọt bé dại dễ cất cánh khá.Cơ chế hoạt động của nguồn ESI tương đối đơn giản và dễ dàng. Dưới áp lực loại liên tục, 2 lần bán kính cột bé xíu với hiệu điện cụ cao (2500V), peptid sẽ được xịt tơi thành các giọt nhỏ tuổi nhiều điện tích ra khỏi đầu klặng xịt. Klặng xịt sẽ tạo thành những giọt nhỏ, như đám sương mù (đám mây khí ion), dễ cất cánh tương đối, các giọt này chứa peptid với các yếu tắc dung môi khác. Quá trình cất cánh tương đối được triển khai vì ánh nắng mặt trời hoặc màng chắn khí nitơ (curtain gas) tạo nên mẫu dễ bay hơi. Kết quả là chỉ với peptid tích năng lượng điện với bay vào thành phần so với kăn năn của máy khối phổ thường xuyên MS/MS.
  
*
 Ngược cùng với MALDI, mối cung cấp ESI ion hóa mẫu mã vào dịch lỏng. khi đó peptid vẫn trường thọ sinh sống dạng ion cũng chính vì chúng đựng các nhóm chức, với năng lượng điện của bọn chúng phụ thuộc vào vào pH của dung môi. Tại quý hiếm pH axit (pH 3,5 hoặc tốt hơn) protein/peptid đang với điện tích dương cùng được phân tách bởi sắc đẹp ký kết nano nhiều chiều xuất sắc hơn <3>. Do kia, nguồn ESI hay được kết nối trực tiếp cùng với hệ dung nhan ký lỏng và thường đối chiếu những peptid ở chính sách ion dương. Hệ ESI-MS/MS gồm ưu điểm là tự động, ion hóa cao, có khả năng liên kết biến hóa năng động với nhan sắc cam kết cùng kăn năn phổ, peptid thường sinh hoạt tinh thần đa năng lượng điện (+2, +3...). Trạng thái tích nhiều năng lượng điện tạo cho quý giá m/z tương xứng với giải kân hận chất nhận được của các phần tử phân tích khối hận như quadrupole cùng ion-trap. Hệ nanoLC-MS/MS có thể phân tách tất cả hổn hợp protein phức hợp cùng với hàng vạn protein được nhận dạng. 
*
Có bố loại phần tử phân tách bóc kân hận liên tiếp MS/MS (tandem mass analyzer) là triple quadrupole (hình 12), ion-trap với quadrupole-time of flight.
*
Mặc dù các bộ phận so với kăn năn này hoạt động khác nhau mà lại bọn chúng có phổ biến một tác dụng là phân tách khối hận các ion trong năng lượng điện trường. Hỗn hợp ion được hình thành tự mối cung cấp ESI sẽ tiến hành trải qua phần tử phân tách bóc khối hận tiếp tục nhằm phân bóc, tuyển lựa cùng vào phòng phân mhình ảnh CID (collision-induced dissociation).  Ion peptid sẽ ảnh hưởng phân mhình ảnh thành các đoạn bé dại rộng được đo với ghi phổ trên detector. Quá trình phân mhình ảnh liên tục được Call là quy trình tiến hành MS/MS.Các phần mềm tin sinch họcCông ráng proteomics đặc biệt lắp thêm ba là các ứng dụng tin sinh học tập. Các ứng dụng này rất có thể đối chiếu, tra cứu tìm và cung cấp hiệu quả nhận được bên trên những cơ sở dữ liệu. Các phần mềm thời buổi này trở nên tân tiến hết sức dạn dĩ, đây là nghành nghề dịch vụ tin sinc học mới lạ và thu hút. Những tài liệu thực nghiệm thu được thực sự phải phân tích bổ sung cập nhật bởi các phxay test và thuật toán thù trên máy tính xách tay <55>. Do đó từ sự cải cách và phát triển các ứng dụng đối chiếu, đối chiếu hình hình họa gel 2D nlỗi PD Quest, Quantity one (Bio-Rad), Progenesis (Nonlinear Dynamics) mang đến những tài liệu so với về kân hận phổ, và nhiều chế độ đã có cung cấp cùng rất các trang bị tương ứng nlỗi MASCOT (Matrix Science) hay SEQUEST (Thermo Finnigan). Các phần mềm này được dùng để làm so sánh phổ MS/MS thực nghiệm thu sát hoạch được cùng với phổ định hướng từ trình tự những protein trên đại lý dữ liệu (Swiss-Prot, EST sequence data, Genomics sequence data).Một số phương pháp trực tuyến đường bên trên Internet qua đều link được cung cấp tự ExPASy (www.expasy.ch/tools.html) <56>. Lúc bấy giờ, những phần mềm dự đoán cấu trúc, tác dụng cùng địa điểm của protein cũng trở nên tân tiến cực kỳ khỏe mạnh nhỏng QuickGO (http://www.ebi.ac.uk/ego/index.html), amiGO (http://www.geneontology.org/). Những lao lý này có thể chấp nhận được không chỉ nhấn diện, Hơn nữa xác minh phần lớn công dụng, từ bỏ các trực thuộc tính lý-hóa cơ phiên bản cho dự đoán các cải biến chuyển với cả mọi cấu tạo ba chiều của protein. Những đại lý tài liệu về những protein được chú giải, cũng giống như về hình hình họa năng lượng điện di hai chiều là vấn đề chủ quản của bioinformatics trong nghiên cứu proteome.

Xem thêm: 12 Phần Mềm Nghe Nhạc, Xem Phim Miễn Phí Hay Nhất Hiện Nay, Cài Và Sử Dụng Media Player Classic

Các các đại lý dữ liệu về trình trường đoản cú gene và proteinProteomics - công nghệ về hệ protein được kế thừa, cách tân và phát triển bên trên cơ sở phần nhiều thành quả đạt được của genomics, với đa số dựa trên những đại lý dữ liệu về trình tự gen và protein. Bên cạnh đó, sự cải cách và phát triển của các kỹ thuật bắt đầu nlỗi điện di hai phía (2-DE), dung nhan ký kết lỏng nano nhiều chiều (nanoLC), kân hận phổ (MS) cũng đang tạo ra một vài lượng to con các số liệu. Tất cả những dữ liệu nói bên trên đang rất được giải pháp xử lý, hợp tuyệt nhất với có thể chấp nhận được dễ dãi thực hiện cho việc đào bới tìm kiếm kiếm.Lúc bấy giờ các cơ sở dữ liệu béo nhỏng NCBI (Mỹ), Swiss-Prot (Thụy Sĩ), Gene Ontology Annotation, European Bioinformatics Institute-EBI (Châu Âu), HUPO (Human Proteome Organization) (nhiều quốc gia), HPPhường (Human Plasma Proteome), PDB (Protein Data Bank) đã cùng sẽ cách tân và phát triển cực kì mau lẹ. Lư­ợng lên tiếng phong phú do các nghiên cứu và phân tích về proteome đem về hoàn toàn bổ trợ đến phần đông ban bố di truyền từ đông đảo phân tích về genome. Proteomics đã là đại lý cho việc cách tân và phát triển của genomics chức năng. Sự phối kết hợp thân genomics, proteomics và bioinformatics đang nhập vai trò chủ yếu trong những nghiên cứu và phân tích về sinh-y học, là nền tảng cho sự cải cách và phát triển các thành phầm chẩn đoán cùng điều trị vào t­ương lai.

Chuyên mục: Kiến Thức